血清游离轻链与多发性骨髓瘤诊断

河东狮

       以下描述来源于Levinson和MacFate 1946年出版的标准教科书《临床实验诊断学》：

Bence Jones蛋白试验
       原理：室温和体温下，Bence Jones蛋白在尿液中是可溶的，当尿液加热至40℃时出现白色雾状物，加热至60℃时出现沉淀，此沉淀在煮沸时消失，温度下降时又出现。加入醋酸或盐会使沉淀溶解。
       试剂：醋酸、接近10%的水溶液。
       步骤：将尿液加入6in（1in=2.54cm）长的试管中至2/3处，再放入水箱中缓慢加热，注意不要让试管底部接触烧杯底部，在水箱中悬浮一个温度计，每隔几分钟观察温度计及尿液变化情况，尤其当温度处于40—60℃时。若尿液加热至沸点100℃时出现少量的云雾状物，加入少量醋酸溶解分离出的磷酸盐。若沸点时出现沉淀物，此沉淀物即为蛋白质。加入少量醋酸煮至沸腾，迅速过滤。在冷的尿液中重复此试验。
       解释：多发性骨髓瘤、骨肉瘤、软骨瘤及癌症患者的尿液中可发现Bence Jones蛋白。
       在对Bence Jones蛋白的临床和科学观察研究中，电泳技术已被用在临床试验中分离蛋白。Longsworth等在1939年通过对多发性骨髓瘤患者血清的电泳跑胶中看见一尖峰。20世纪50-60年代，电泳从以纸膜为基质发展为纤维醋酸膜为基质。最终，免疫固定电脉法（IFE）于80年代被最终建立。
       应用特异性抗体可以将κ和λ分子清楚地区分，最初使用免疫扩散法，1953年开始使用免疫蛋白电泳法，后来应用放射免疫弥散法、比浊法等。然而Bence Jones蛋白的血清检测（血清FLC-血清FLC）仍不能实现，因为所有抗体不能区分游离链和结合在免疫球蛋白上的结合轻链。
       最初成功地检测血清FLC是在1975年，采用色谱技术按分子质量大小分离血清后再检测FLC，尽管该法具有较高的敏感性和准确性，但是在临床工作中难以开展为常规检测。后来的分析集中在开发能够发现FLC分子隐藏位点的抗体。这些隐藏位点位于完整的免疫球蛋白重链和轻链的接触面上，当FLC被释放时可测出。20世纪80年代开始为提高特异性采用单克隆抗体检测FLC，但是检测试剂难以开发满足临床需要，而且单克隆抗体检测只限于放射免疫法和酶免疫法。90年代中期开始采用免疫比浊法使用多克隆抗体检测血清FLC，可以应用多克隆FLC抗血清进行放免检测法来分析尿液样本，但对于血清样本其特异性仍不够，同时由于FLC易形成多聚体而导致检测结果不准确。
       单克隆抗体的应用很大程度增加了其特异性，但很难找到令人满意的试剂，单克隆抗体的应用仅限于放射免疫法和酶联免疫法。应用多克隆抗体来开发比浊法及乳胶增强比浊法检测已经做了很多尝试，但它们无法检测到正常血清水平的FLC，由于其与完整免疫球蛋白发生交叉反应，因此也无法应用。在2001年，免疫检测法以多克隆抗体为基础最终发展成可以检测正常血清水平的FLC。这些方法被应用后，在许多曾被归为非分泌型多发性骨髓瘤（NSMM）的患者血清中检测到了单克隆的FLC。此外，《柳叶刀》杂志曾提到过在224例伴有Bence Jones蛋白尿液的轻链型多发性骨髓瘤（LCMM）患者中其血清FLC也是升高的。血清FLC检测在监测微小留病灶方面优于尿液FLC检测。进一步的研究表明，血清FLC检测可以用来筛查有症状的患者比尿液检测FLC更敏感，并且是MGUS的疾病进展的监测指标。
       这些结果预示了随着血清FLC免疫检测的广泛应用，Bence Jones蛋白和Bence Jones蛋白尿的故事在持续160年后将演至剧终。

一、血清游离轻链与多发性骨髓瘤
       多发性骨髓瘤是一种多样性疾病。本病多见于老年人，年轻人也可发病，以骨痛和骨折为主要临床特征，也可表现为软组织浆细胞瘤，患者可在几周内死亡，也可较长时间稳定在冒烟期。患者可出现肾脏衰竭、急慢性感染或淀粉样变，治疗上需要造血干细胞移植，大剂量化疗等。因此，许多专家如血液学家、肾病学家、免疫学家、整形外科医生及病理学家等均开始研究此病的机制问题。此外，多发性骨髓瘤的发病率缓慢增长的同时，生存期逐渐延长。
       尽管本病比较复杂，但有一个特征像迷雾中的灯塔一样，指引了多发性骨髓瘤的诊断和发病机制，即单克隆免疫球蛋白的表达。160年前，Henry Bence Jones首次将这种过表达且具有千变万化的形状、大小的分子与多发性骨髓瘤联系在一起。将游离轻链（FLC）作为肿瘤标志物进行检测已历史悠久，但一直是有缺陷的，并且始终落后于其他领域的研究。
       许多肿瘤的血清学试验是在已有的免疫检测和自动化的基础上完成的（表1为常见血清标志物的选择）。与之相比，多发性骨髓瘤和淀粉样变的试验是基于旧式的电泳技术。该技术敏感性低，试验者必须经验丰富，且劳动强度大。具有讽刺意味的是，第一个肿瘤标志物是最后一个从现代技术中获益的。

       也许，应用上述技术检测FLC产生误差是不足为奇的。为什么要检测尿液中的FLC呢？很难想象把尿液作为检测FLC的理想标本。肾脏的主要功能是阻止FLC和其他小分子蛋白进入尿液，同时，尿液量多，获取和运送均不方便，且需要浓缩后分析。
       一个可选择的策略是检测血清中的FLC。1981年的研究显示当Bence Jones蛋白尿产生时，血清FLC浓度上升，并且在肾脏功能衰竭患者的诊断中，血清检测要比尿液检测更准确。那么为什么之前不开展血清FLC的免疫检测呢？
       主要问题在于难以克服交叉反应且找不到令人满意的抗体。最理想的检测血清FLC的方法不仅要有敏感性，即使很低浓度也能测出，还要有特异性。血清FLC的浓度比结合在完整免疫球蛋白上的血清轻链的浓度要低，即使极少的抗体交叉反应也会产生不可接受的后果。
       直到最近才发现只针对FLC的隐藏位点的比较合适的抗体，使得血清FLC的检测是特异、敏感和定量的。
       血清FLC免疫检测有以下优点：比目前的电泳分析技术更具有敏感性和准确性；疾病的监测可量化；血清样本方便取样；可鉴别传统试验无法鉴别出的AL型淀粉样变性和非分泌型多发性骨髓瘤，是判定疾病是否完全缓解的更精确指标；半衰期短，迅速评定疗效；可以评定意义未明的单克隆免疫球蛋白病的个体的预后；更好地筛查有症状患者；识别并监测骨髓瘤患者的肾脏疾病。

二、血清FLC在多发性骨髓瘤中的临床应用
       1、有症状患者的鉴别诊断。血清FLC有助于对有临床症状如骨痛、骨折，骨髓活检可疑，及无法解释的肾脏损伤的患者进行鉴别诊断。
       2、疾病的临床分期。血清FLC浓度与单克隆疾病的进展有关，有助于评定治疗后的残留病灶。
       3、评定肿瘤负荷。在疾病诊断时，血清FLC浓度与肿瘤负荷不相关，但在治疗过程中血清FLC浓度变化与肿瘤负荷变化是高度相关的。
       4、疾病的预后指标。有证据表明检测MM患者血清FLC对判断预后意义重大，已缓解而FLC浓度高的患者有早期复发的风险。还可以作为判断（MGUS）预后的指标，最近研究表明单克隆FLC的升高是评定浆细胞疾病预后最敏感的因素。
       5、评价疗效。FLC检测对于AL型淀粉样变性、轻链型多发性骨髓瘤及非分泌型多发性骨髓瘤的疗效评价尤其有意义。同时研究表明，由于FLC半衰期短，可用于评价几乎全部单克隆球蛋白病患者的早期疗效，目前许多研究还在进展中。
       6、监测肿瘤复发。血清FLC检测可用于监测疾病复发，尤其对AL型淀粉样变性、轻链型多发性骨髓瘤及非分泌型多发性骨髓瘤的患者较其他技术更加敏感，也适用于一部分分泌完整免疫球蛋白的多发性骨髓瘤患者和一些其他单克隆免疫球蛋白病的患者。
       7、筛查有症状的患者。起初，有多发性骨髓瘤或相关疾病症状的患者通过血、尿电泳测出单克隆免疫球蛋白而被筛查出来，目前研究显示血清FLC检测可以筛查出更多的患者，可以取代尿液FLC检测。
       8、筛查一般人群。证据表明血清FLC检测筛查出许多新的MGUS患者，这些患者既往被认为是健康人。作为成功的筛查试验，标准之一是使被筛查出的人群受益，在这种情况下，血清FLC检测是否能够成为成功的筛查试验还需要很多年才会有答案。
       另外，鉴于血清FLC检测的敏感性、特异性，许多诊断和监测多发性骨髓瘤、AL型淀粉样变性及其他产生过多FLC的疾病的新的指南将加入血清FLC这一指标。

       备注：本文根据《Serum Free Light Chain Analysis》和《血清游离轻链检测分析》整理而成，版权归原作者所有
                                                                              摘自定向点金《临床实验室》杂志2014年第五期
                                                                                                        编辑：范伟伟