互换性依然是问题

老七

作者：冯仁丰

引言

2013年9月美国《Clinical Chemistry》上刊登了2篇文章,一篇是杂志社论题为“互换性依然是问题”,由著名的标准化专家Dr. Miller编写。另一篇是参与ERM470参考物质制备的参与者Zegers写的,题为:“用作校准品的参考物质互换性的重要性,铜蓝蛋白的示例”。这是2篇对临床实验室追求患者结果一致性非常重要的文章[ 1, 2]。

临床实验室一直在努力寻求如何使天然临床患者样品,不论实验室在何处、何时,不论使用什么常规检测方法,都能得到可比较的结果。为此,从上世纪40年代起,努力建立一个国家或地区的标准方法(如美国临床化学协会出版了6本临床化学标准方法的书籍[ 3],德国、北欧斯堪的纳维亚和法国等的推荐酶学方法[ 4, 5, 6])、在全世界建立参考方法[如国际临床化学学会(IFCC)几十年致力于研究并形成多个酶学检测的参考方法[ 7]]、研究开发参考物质[如世界卫生组织(WHO)、美国国家标准和测定研究院(NIST)的SRM系列、IFCC的参考物质系列等]。所有这些努力全部是为了使临床实验室使用这些参考物质和参考方法后,使日常患者样品的检测结果在不同实验室间、不同检测方法间实现检测结果的可比性。这些努力首先被认识为“标准化”。

如何规范所有临床实验室在进行标准化中的行为和做法?国际标准化组织(ISO)从上世纪末起,专门针对临床实验室发布了许多标准文件。ISO17511是指导实现患者样品检测结果可比性中如何让诊断试剂厂商到临床实验室的传递,将参考物质或参考方法的可靠性通过溯源链将参考系统的正确度传递给检测系统的校准品,然后常规实验室使用具有溯源性检测系统,使最后对患者样品的检测得到可溯源的结果[ 8]。期望这样去实现患者样品检测结果的世界大同。我国从本世纪初认识了溯源性(traceability)的重要性。由此,几乎大家有一个统一认识:检测系统必须要有溯源性,如果没有溯源性的不用。可惜在我国的现实条件下,这样的认识退化为:只要使用具有溯源性的校准品,检测结果就符合了要求。所以,诸如罗氏c.f.a.s等校准品走遍中国;因为连国家药品监督机构也认为,只要报批产品(注意:只是试剂盒!)使用如c.f.a.s等校准品为试剂盒配套的,都认为这样的试剂盒在常规实验室就可以实现溯源性!殊不知,只有完整检测系统(即仪器、试剂、校准品和操作程序的组合)中包含的校准品,才使该系统对患者样品的检测可以实现溯源性!可是从那时候开始,厂商说他们的产品好无一不说溯源性;临床实验室在被ISO15189认可时,也时时说自己的检测结果有溯源性!溯源性成为临床实验室的一个时髦词语。

如果在溯源性上就是那么简单,也许今天的问题还不会这么复杂。在ISO17511标准发布后,很多的专家都乐观地认为,将在以后会出现越来越多的参考物质和参考方法,整个临床实验室的正确度会有很大的改善。时间过得很快,自ISO的标准发布以来已过去了10年。究竟有多少个新的参考物质和参考方法被发布了?糖化血红蛋白是最成功的一个示例[ 9]。其不仅有IFCC认可的参考方法、还有被欧洲参考物质(ERM)批准的参考物质(ERM IRMM/IFCC 466);还有半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatin C,Cys C)于2010年发布了ERM-DA471/IFCC参考物质[ 10]。除此之外,实在没有更多的参考系统被认可(在参阅文献时可能会有遗漏,请见谅)。几乎在同时,制备新的参考物质替代即将用尽的ERM-DA470/IFCC(原CRM470)参考物质,这是专门为14个特定蛋白检测使用的参考物质[ 11]。20年前(1993年)发布的ERM-DA470(原CRM470)确实使这些特定蛋白检测结果质量有了很大的改善。就在重新制备该参考物质中出现了系列问题。除了发现C反应蛋白(CRP)在冻干中因自身不规则凝聚出现问题外[ 12],铜蓝蛋白在定值中出现2个不同系统的检测结果差异很大。因此新的替代参考物质ERM-DA470k/IFCC中[ 12],被认可的特定蛋白为12个(原来是14个)。

2010年,美国临床化学协会(AACC)由Dr.Miller牵头召开了一个重要会议。这个会议认为,实现检测结果溯源性永远是临床实验室的最终目标。但是,如果不认识参考物质与患者样品在各个常规方法中检测结果间的互换性(commutability)实现一致性(harmonization),那么是无法实现溯源性的。而且为此于2011年编写了专题文章“临床实验室检测程序一致性的途径”[ 13]。Dr. Miller博士早于2006年写了社论“为什么互换性是问题”,当时针对肌钙蛋白I的SRM 2921标准物质专门指出互换性的问题[ 14]。

一、溯源性、一致性和互换性的关系

“溯源性”、“一致性”和“互换性”这3个词语在实现检测结果标准化上有着紧密的联系。ISO 17511文件强调的溯源性没有将实现溯源性必须以具有互换性为前提作为必须条件,这是ISO17511的缺陷。因此,尽管各个厂商的检测系统(产品)均以某个参考物质为准,通过患者样品的比对,将该参考物质的正确度传递给校准品,在该校准品校准下,使检测系统对患者样品的检测结果实现了溯源性。但是现实问题是:都说以该参考物质为溯源性依据的各个检测系统对相同患者样品的检测结果的可比性却很差。强烈说明溯源性并没有让患者样品检测结果实现可比性,即检测结果的一致性。溯源性没有实现一致性。

缺了什么?缺了最关键的互换性。这3个词语的关联中,应该首先是参考物质与新鲜患者样品被各个检测系统检测结果具有互换性(即检测结果在数量上相等),由此推动了常规实验室使用任何检测系统对相同患者样品检测结果间的一致性;确保一致性中,厂商必须遵循ISO17511的要求,将参考物质的正确度通过不断进行患者样品比对的溯源性链,最后将参考物质的正确度传递给各个检测系统中的校准品,实现溯源性。这样才能使我们临床实验室实现走遍世界结果可比性的理想。

二、互换性

1973年Fasce等[ 15]提出互换性。“互换性”是参考物质或控制品的能力。这样的物质与真实临床样品被多个分析方法检测展示的检测结果为可比较的,这是这样物质具有检测间的性质。2003年ISO 17511文件中对物质的互换性 (commutability of a material)定义为:对某物质使用2种测量程序得到的测量结果的数学关系,与常规样品量间的数学关系一致性。所以“互换性”为不同检测系统对某个参考物质和来自健康或疾病个体代表样品的检测,得到的结果量值是一致的,也即各个样品或参考物质的检测值可以在不同检测系统间互换[ 16]。

通常参考物质被用于确定或证实某个检测程序可溯源至某物质的定值,该值代表了正确的或对真实值的最佳估计。在可能情况下由较高等级的检测程序,或在没有参考检测程序时由协同过程确定参考物质的浓度或活力。当某个参考物质用于常规临床方法检测,必须在所有方法间确认其互换性。

如某个参考物资的互换性没有被确定,常规方法的结果就不能被正当地与该定值做比较,既不可确定在校准中是否存在偏移,也不可使用该参考物质为校准品。观察到的偏移可以因参考物质的非互换性或被检查方法不同的特异性和校准程序所致。对用于方法比较的某物质没有评估其互换性,不可能确定任何观察到的偏移究竟是因不合适物质的结果还是方法间真正的偏移。

某参考物质的非互换性可因基质的改变或非天然分析物所致。基质效应或基质偏移可因参考物质与天然临床样品间的样品基质差异所致。样品基质包括除了分析物本身外的物质系统的所有组分(成份)。基质效应被确定为样品一个性质的影响,即检测和可检测量值的影响,与存在的分析物无关。分析物的非天然形式,如非人组织的酶与非生理的分子的结合(如双牛磺酸胆红素)或对人来源分离中修饰了蛋白复合物等,可产生与预期分析物天然形式不同的检测信号[ 16]。

互换性是参考物质的性质。参考物质被检测的值与具有代表性的临床样品被检测的值在相同被测量的检测程序的2个或更多个之间具有相同的关系。当某个参考物质将被用于临床实验室检测程序的通用校准品,或将被用于质量评估(能力比对试验)计划去评价检测程序间检测患者样品结果的一致性时要求“互换性”。当参考物质被用于体外诊断厂商作为他们内部溯源性程序,为他们的产品校准品定值时也被要求“互换性”。

三、铜蓝蛋白未被批准为ERM-DA470k/IFCC一个成份的原因[ 2]

2013年Zegers等报告了新参考物质对铜蓝蛋白互换性的研究和证实。ERM-DA470k/IFCC是被制备替代ERM-DA470/IFCC(原CRM470)的。1993年发布的该参考物质以血清为基础,是14个蛋白包括铜蓝蛋白的参考物质。自此之后有相当多的报告认为其改善了常规临床实验室检测程序间对数种蛋白的一致性。但是该物质在制备和以后为各个蛋白定值的过程中没有确认互换性。在以后的应用中,出现ERM-DA470不能使患者样品中的铜蓝蛋白结果实现一致性,因为其缺少互换性。

自新的ERM-DA470k正式发布以来,Zegers等为了更多了解铜蓝蛋白为什么不能被确定为该参考物质中一个确认的蛋白,按照CLSI的EP30-A文件进行了互换性实验。实验观察的结果大致如下。

1.初始决定铜蓝蛋白不是ERM-DA470k/IFCC中一个确认蛋白的原因

开始在制备ERM-DA470k/IFCC替代ERM-DA470时,需要确认ERM-DA470k/IFCC的铜蓝蛋白浓度。当时定值中由13个实验室参与,使用了BN ProSpec、BNⅡ、Olympus AU640、Immage、Abbott和LX-2200等检测系统,Hitachi使用了Roche和Dako试剂。这些检测均以ERM-DA470校准。对新鲜患者样品检测发现:Immage和Abbott方法得到高值,而Olympus、Roche和Dako Hitachi方法给出低值。在还不能充分了解问题原因前,制备者作出了不列入铜蓝蛋白的决定。

2.互换性实验安排

被检测的人血清样品中有被添加了叠氮钠、储存于-70 ℃ 15个月的“陈旧”血清30份;也有新鲜的血清样品,即不添加任何防腐剂和深低温保存。参考物质样品为1支ERM-DA470、3支冷冻干燥的ERM-DA470k/IFCC(12个蛋白的确认值)、3支深低温冰冻的ERM-DA472/IFCC(有CRP的确认值)。ERM-DA470k/IFCC和ERM-DA472/IFCC来自相同的处理过的混合血清,但保存方式不同。有8个实验室使用不同检测系统参加实验。所有参与实验的各个检测系统依然使用ERM-DA470校准,然后检测实验样品。

3.检测系统间比较

血清样品得到的不同方法检测结果均值的变异系数( CV)为1.7%和6.1%。采用Pearson相关系数( r)对所有配对方法时行比较, r均>0.98,说明不同方法间结果有非常好的相关。但方法比较的斜率从0.56到1.42不等,见表1:

表1

这些值显示了相同血清样品的检测在不同方法间具有非常离散的结果。表1概括了ERM-DA470互换性的问题。所有检测系统对于ERM-DA470的铜蓝蛋白定值很接近确认值(0.205 g/L),扩展不确定度为0.011 g/L。说明每个检测系统均具有良好的溯源性,可溯源至ERM-DA470。但是这些检测系统在检测新鲜患者样品时,两两检测系统间比较的回归斜率差距只能说明ERM-DA470在检测系统间缺乏了相当的互换性。当然,在有些检测系统如Roche Integra、Roche Hitachi、Dako Hitachi和Dlympus AU 2700间的组合是互换的,但Dako Hitachi与Abbott architect、Immage、BN ProspecⅠ的组合却缺乏了互换性。

4.新鲜血清和各个参考物质在不同检测系统间比对

依然使用ERM-DA470为各个检测系统校准。各个检测系统检测新鲜患者血清样品与ERM-DA470、ERM-DA470k和ERM-DA472参考物质的比对结果以回归统计归纳分析。图1(a)为Beckman Immage和Dako Hitachi的比对。由图说明整个血清铜蓝蛋白检测结果,Dako Hitachi明显低于Beckman Immage,以Beckman Immage为准的斜率约0.56。最奇怪的是3个参考物质在这2个系统进行比对时,却均在血清检测回归统计的95%分布范围之外;特别是ERM-DA470对于回归线的偏离最大。充分说明这3个参考物质与这些新鲜患者血清在这2个系统比较中,没有互换性。图1(b)是Abbott系统与AU2700系统的比对。回归线的斜率为0.92;所有3个参考物质均在血清比对的95%分布范围内。图示说明这3个参考物质在这2个系统的比对中,与患者血清具有互换性。

图1

图1 各检测系统检测新鲜患者血清样品与ERM-DA470、ERM-DA470k和ERM-DA472参考物质比对结果的回归分析
5.空间质量评估(EQAS)数据

Zegers还对2001~2008年间的英国实验室间质量评估(UK NEQAS)的混合血清数据做了分析。这些下发的混合血清有储存于-70 ℃,有不加防腐剂,也有加叠氮钠(1 g/L)或Bronidox(1 g/L)。同一混合血清在第1次和最后1次的4~16个月间分发2~3次。这些数据中也有的是新鲜样品和保存了不同时段后样品的结果。观察到下列趋势:(1)新鲜的EQAS样品,不同检测系统得到的结果间有系统偏移;(2)添加叠氮钠后冰冻储存的血清(文献中被称为“陈旧”血清),在检测系统比对中与新鲜患者血清表现不一,但其很像EQAS样品或像参考物质那样的表现。Zegers认为检测铜蓝蛋白中参考物质ERM-DA470的表现很类似陈旧的患者样品。在陈旧ERM-DA470作为新鲜EQAS样品结果的溯源性基础时,方法间的变异很高。但陈旧ERM-DA470为陈旧EQAS样品提供溯源性时,方法间变异非常小。事实上,厂商已经用其将值转换给自己(in-house)和试剂盒校准品,造成了新鲜样品的检测系统间变异。但是对储存过的样品进行铜蓝蛋白的检测时,储存过样品内铜蓝蛋白的性质类似ERM-DA470;由EQAS分发这样样品的检测系统间变异非常低。所以,检测系统间变异在很大程度上可以用ERM-DA470缺乏互换性来解释。新参考物质ERM-DA470k/IFCC表现像新鲜患者样品。有提议认为,在储存中,铜蓝蛋白结构的变化导致抗原-抗体结合特性的改变。但是,需要做进一步研究才可全面理解因存放过程导致分子的改变。

四、互换性问题的复杂性

参考物质和新鲜患者样品中铜蓝蛋白间,在各个检测系统间没有互换性。这是没有对参考物质ERM-DA470k/IFCC确定铜蓝蛋白定值的根本原因。

综合目前对互换性问题的理解,大致上可以认识以下几点:

1.至今出现互换性问题的分析物(平时称为检验项目)其实都是一个大家族

也许我们连真正被检测的那个分析物分子及其结构完全不了解。追求溯源性的重要原则是必须在参考物质和新鲜患者样品中被检测系统检测的是相同的被测量(measurand)。可惜,我们对许多许多分析物的被测量是什么还不知道,何谈溯源性!因此,明确分析物的被测量是实现互换性、一致性、乃至溯源性是头等大事。

2.按照溯源性分类要求,一级参考物质应该是纯物质,二级参考物质是含有基质的物质

为了获取参考物质,必须对样品使用各种分离、纯化手段。任何对原始样品的处理、提取都是对原先样品中分析物的破坏或损害。因此,即使得到了某个参考物质,极有可能本身已经丧失了原先的分析物的分子结构,至少被修饰或丢失了始终在一起的某个分子或片段。所以,也许只有小分子物质的纯化产物可以是原先在天然样品中的那个分析物分子。可是,今天在追求溯源性的大多是以免疫方法为检测手段的较大或大型分子。有了抗体就会建立免疫方法进行检测。期望形成参考物质时,不断实践才发现问题的复杂性。肌钙蛋白I参考体系的困难就是一个范例。

3.样品中的基质状态

为了关注检测样品中的基质状态,二级参考物质以诸如血清等为基础,添加部分分析物(被部分纯化的某分析物、纯分析物或来自动物来源的某些物质),也加入防腐剂(如叠氮钠)等;最后被冷冻干燥。为了使这样的参考物质在冻融时不会出现浑浊,事先去除血清中的α脂蛋白;可是又引入了更多的处理和去除更多原血清中的成分。所有这些使制备的参考物质与新鲜患者血清间产生了许多尚不了解的差异。这些差异不仅是被检测分子的差异,更是非分析物组成的基质差异。凡此种种,使这样的参考物质与新鲜患者血清的互换性遭遇了严重问题。

4.任何一个物质不稳定是绝对的,稳定是相对的

刚刚制备的参考物质在发布时非常完美,与新鲜患者血清间呈现出良好的互换性,使许多检测系统对新鲜患者样品的检测结果间实现了一致性,也许确实会被某些组织确认其溯源性。可是随着参考物质的存放时间延长,分析物分子或参考物质基质二者或任一个可能会发生微小变化,出现原先互换性的变化、分析物定值的变化等。

五、互换性依然是问题

被仰望的参考物质,曾经在大家的心目中是最神圣的,应该是正确性的象征。可是随着科学技术的不断发展,人们对自然的深入了解,现在也对参考物质的可靠性在逐渐认识。这不是什么倒退,而正是使我们的认识更加贴近真实。

实现临床实验室在任何时候、任何地方、使用任何方法(检测系统),可以对相同的患者样品得到相同的结果,这是我们的愿望。为了这个愿望,我们的前辈为此做了许多的努力。面对新的认识,临床实验室的人不会知难而退,相反会更加激励我们共同努力,克服每一个难关。总有一天我们会实现我们的理想!

我一直认为,如果我们在任何时候始终以新鲜患者样品为实验对象,始终以方法学比较作为度量是否实现可比性,去度量使用的校准品或控制品是否与患者样品间具有互换性,我相信我们的实验室结果可比性一定会不断改善。

这也是Dr. Miller那篇社论的真实含义[ 1]。由衷希望我们的临床实验室同仁不断刻苦学习和实践,使我国的临床实验室检测质量不断改善。

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