经输血传播病原体相关检测

河东狮

       李金明，研究员，医学博士，博士生导师，卫生部临床检验中心副主任。享受国务院政府特殊津贴，获2009-2010年度卫生部有突出贡献中青年专家称号。自上世纪90年代以来，在国内系统提出了临床分子诊断质量管理和标准化的概念和方法。研究方向为：临床分子诊断方法及标准化。以项目负责人承担国家自然课题5项，863课题1项，传染病重大专项课题1项。以第一和通讯作者发表论文160多篇（其中SCI 论文49篇）。经第一完成人获北京市科技奖贰等奖1项，叁等奖2项。

       经输血传播病原体通常有乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）、梅毒螺旋体（TP）、西尼罗河病毒（WNV）、嗜人T淋巴细胞白血病病毒（HTLV）等。目前，国内采供血机构针对上述病原体对献血员血液筛检的特异抗体原和抗体标志物共有4种，即乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、丙型肝炎病毒抗体（抗-HCV）、人免疫缺陷病毒抗体（抗-HIV）和梅毒抗体，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测，方法模式为双抗体夹心法、间接法和双抗原夹心法等。所使用的仪器设备主要有酶标仪、洗板机、全自动酶免疫分析系统和全自动加样系统等。病毒核酸检测标志物是HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA。采用实时荧光聚合酶链反应（PCR）和转录介导的扩增（TMA）方法检测，所使用的仪器设备主要有全自动核酸提取仪、实时荧光PCR仪、COBAS s201检测系统、Procleix Tigris检测系统等。

一、特异抗原和抗体的ELISA检测及其局限性

       长期以来，在我国采供血机构实验室对献血员血液采用两种ELISA试剂检测上述4种病原体的特异抗原和抗体，当两种试剂检测均为阳性，则血液废弃，如果一种阳性，一种阴性，则检测呈阳性试剂复检一遍，如果仍为阳性，血液废弃，为阴性，则血液放行。血液筛查质量的高低，直接关系到受血者的安全。国内采供血机构在血液筛查检测上，质量在不断提高，但在不同层次的采供血机构，仍不同程度的存在一些时常困扰基层实验室工作人员的问题。一是两遍ELISA筛查的必要性；二是ELISA检测的“窗口期”较长。

       两种ELISA试剂对献血员血液的两遍筛查具有中国特色，欧美及其它国家都是单遍免疫检测。的确，对于HBsAg、抗-HIV和梅毒抗体，选用高质量的ELISA试剂，有严格的质量控制，单遍检测应是可以满足要求的。但抗-HCV的检测，试剂经历了第一代、第二代和第三代的发展历程，所用抗原涉及HCV的NS3、NS4、核心区和NS5区（仅第三代试剂有），较为复杂，其中NS3为基因重组抗原，其它可为合成多肽。不同试剂的抗原来源及其包被组合和每种抗原包被量等均可能有所不同，再加上HCV感染后，机体对HCV不同抗原产
生抗体应答上亦有差异，通常以针对NS3的抗体最早出现，针对NS4和核心抗原的抗体出现亦较早，且可在血循环中长时间高浓度存在。因此，同一份HCV感染者标本采用不同的抗-HCV ELISA试剂盒检测，就可能得到不同的结果，尤是稍弱阳性的标本。因此，抗-HCV的两遍检测能有效避免上述标本的漏检。

       经输血传播病原体特异抗原和抗体的ELISA的另一个需要注意之处，是对检测结果稍低于Cut-off值的血液如何处理的问题。这里有一个ELISA测定“灰区”的概念，所谓“灰区”，即处于Cutoff值周围一定范围内的测定结果。在定性免疫测定中，确定合适的阳性判断值对减少假阳性和假阴性具有重要意义。阳性判断值的上移或下移，可导致假阳性或假阴性结果的出现，阳性判断值的确定通常是根据对大量阴性和阳性人群的测定结果，采用统计学方法确定，使得依其判断结果的假阳性和假阴性率最低，处于阳性判断值周围一定范围内的测定结果可归为可疑，亦即ELISA测定的“灰区”。“灰区”的大小由统计学方法确定。测定结果处于“灰区”的样本，稍高于Cut-off的，很可能为假阳性，反之，稍低于Cutoff的，则可能为假阴性，后者对于血液安全来说，是一个潜在的危险。因此，用于血液筛查检测的ELISA试剂盒有必要确定一个“灰区”的下限，尽管如此可能会导致个别正常血液的废弃，但对于保证输血安全是有意义的。

二、病毒核酸检测（NAT）的应用

       通常机体感染HBV、HCV和HIV等病毒后，最早出现于血液中并不是特异抗原和抗体，而是病毒核酸，通常我们将机体感染病毒后，至能检测到核酸和特异抗原及抗体称为检测的“窗口期”。对于HBV来说，HBsAg检测窗口期通常为2个月左右，而检测HBV DNA窗口期将缩短至1个月左右，HCV窗口期可从3个月缩短至不到1个月，HIV则可从20天左右缩短至10天左右。目前常用的NAT检测技术是实时荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和转录介导的扩增（transcription mediated amplification，TMA）。前者以罗氏COBAS s201系统为代表，目前，国内NAT试剂厂家也是采用这种方法。后者以Procleix Tigris系统为代表。在自动化仪器上可以以混合样本的形式检测（MP-NAT），也可以单一样本逐一检测（ID-NAT）；可以先检出阳性结果后，再拆分出特异的病毒类型，也可以同时分类检测HBV，HCV和HIV（MPX）。

       为保证血液安全，欧美等发达国家从上世纪90年代中后期即尝试对献血员血液进行核酸检测（表1），采用的核酸扩增检测技术即这上述的实时荧光PCR和TMA，通常采用数份血液样本的混合检测方案，在发现有阳性反应的样本后，再进行拆分，也有一些国家进行的是单检。NAT的开展大为降低了经输血传播疾病的风险，表2是一些国家公开发有的文献报道的残余风险度。

       我国最早将NAT用于常规血液筛查的血站是深圳血液中心，开始于2006年。2010年2月卫生部发文《卫生部办公厅关于开展2010年血站核酸检测试点工作的通知》[卫办医政函[2010]226号]，从2010年6月开始在全国血站进行NAT试点，试点单位共15家。为使血站核酸检测试点顺利进行，卫生部临床检验中心在卫生部发出通知后，于2010年3月在深圳举办第一期血站核酸检测实验室技术人员上岗培训班，其后，又分别6期培训班。培训内容主要为核酸生物化学基础、血站核酸扩增检测实验室设计及工作流程、标本的采集运送
与保存、血站核酸检测的质量保证等。为血站核酸检测实验室的设计、质量保证体系建立提供了最重要的人员基础。2013年国家卫生计生委发布了《全面推进血站核酸检测工作实施方案（2013-2015年）》（卫计生发[2013]22号），要求到2015年，血液筛查核酸检测基本覆盖全国。核酸检测技术全面推开以后，根据卫生部在2012年发布的新的《血站技术操作规程》（卫医政发〔2012〕1号附件），血站在进行血液筛查，可以采用一遍ELISA和一遍NAT的方案，这样核酸检测最终将成为我国血站血液筛查的常规方法，将有力地促进我国的血液安全，极大地降低经输血传播疾病风险。

                                                                                摘自定向点金《临床实验室》杂志2014年第五期
                                                                                                          编辑：范伟伟