重视纸片扩散法药敏试验的主要影响因素

海风100

       监测细菌的耐药性是临床细菌室的重要工作。我国采用美国临床实验室标准委员会(NCCLS，现更名为美国临床实验室标准化研究所，CLSI)推荐方法作为药敏试验的操作规程，其中文译本和专家发表的NCCLS标准的变更内容，详细而及时地对广大基层检验人员起到培训和指导作用。在药敏试验方法中，纸片扩散法是操作简便、使用广泛的方法，而且在细菌重要的耐药机制检测中也是实用的方法。如协同试验可检出80%~95%的超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)，实验室筛查AmpC β-内酰胺酶(AmpC β-lactamases，AmpCs)、金属β-内酰胺酶，耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin-resistant staphylocoocus，MRS)异质性耐药的观察等。此外，纸片扩散法能够直接观察到污染菌以及抗生素间的协同、拮抗作用。但是，因各实验室条件的不同，纸片扩散法应特别注意下列因素的影响，现将观察总结如下，供同道们参考。
MH琼脂质量
       国内生产的MH 琼脂(Muller-Hinton)存在质量问题，表现在用金黄色葡萄球菌ATCC25923测试甲氧苄啶/磺胺甲恶唑纸片，抑菌环中生长菌膜，劣质的MH琼脂甚至测不出抑菌环而错误判断葡萄球菌耐药。用粪肠球菌ATCC29212或ATCC33186测试甲氧苄啶/磺胺甲恶唑纸片无抑菌环。这是国内MH培养基制造中尚存在的难题，只有解决原料中的胸腺嘧啶核苷酸和胸腺嘧啶的干扰问题，才可望生产出优质的MH琼脂。
       另外，实验室自制MH平板应定量加注，保证平板厚度一致。如直径9cm平皿，定量加入25 mL灭菌MH琼脂。还应注意商品一次性MH平板在冰箱中存放析出水分而影响使用，以及存放时间过长对结果的影响，干粉培养基结块变质不要再使用。
药敏纸片稳定性和室内质控
       采用标准的纸片扩散法，对新制备的某国产药敏纸片(包括β-内酰胺类、氨基糖甙类、氟喹诺酮类、糖肽类、大环内酯类、四环素类、氯霉素等)40余种，测试不同存放温度下的纸片抑菌环直径。结果为-15℃保存12个月，亚胺培南纸片测不出抑菌环；在8℃冷藏6个月，亚胺培南、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、青霉素、苯唑青霉素、头孢他啶、头孢噻肟的抑菌环直径低于质控标准或无抑菌环；而在35℃存放1周(放35℃恒温箱中)除上述纸片外，头孢西丁、头孢吡肟抑菌环直径均低于质控标准。同时，对部分进口药敏纸片也进行了35℃“破坏性”试验，存放35℃恒温箱中2周后，苯唑青霉素纸片抑菌环直径低于质控标准。延长破坏时间，青霉素等纸片失效。这是一个现实问题，在炎热的季节不能邮寄药敏纸片，实验室应提前储备。即使放冰袋特快传递，在偏远的地区也难以保证纸片在途中不失效，普通邮寄就更难保证质量。不稳定纸片应冰冻保存，并且，每周定期的室内质控不可缺少，这样可以及时发现纸片失效，失效纸片应丢弃。上述不稳定纸片在耐药机制监测中，是重要的“指示药”(如MRS、ESBLs、AmpC 酶等)，需特别注意这些不稳定纸片的有效性，保证药敏试验结果的准确。药敏纸片从冰箱拿出要与室温平衡20 min后使用，以免潮湿影响。相对来说，进口纸片稳定性较好，不稳定纸片可选用进口纸片。
       此外，在对国产40余种药敏纸片观察中，发现大肠埃希菌ATCC25922对氨苄青霉素，铜绿假单胞菌ATCC27853对亚胺培南抑菌环的下降最敏感，它们会早于其他细菌检出失效，在室内质控中需重点注意。总体上讲，不稳定纸片在三个标准菌株中具有相似不稳定性。
菌液浊度
       药敏试验菌液浊度最好用浊度仪调整，无条件时也应采用标准的比浊管比浊，使每次菌液的浓度得到控制。直接菌悬液法，需取新鲜生长物制备。还应注意比浊管使用时间过长出现颗粒时浊度下降。本实验室观察到菌液浊度对质控菌金黄色葡萄球菌ATCC25923的抑菌环影响最明显，当浊度低于0.5麦氏单位时，阿米卡星、氨苄青霉素、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢西丁、氟喹酮类、苯唑青霉素等抑菌环会扩大3 mm左右，细菌菌液不比浊直接涂布平皿，影响药敏结果的准确性。
抑菌环边缘不齐
       实验室对纸片扩散法药敏试验的抑菌环边缘整齐、清晰的程度不太重视，但抑菌环边缘不齐可造成人为量取误差，影响结果的判读。用金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853三株标准菌株测试国产的40余种抗生素纸片，结果铜绿假单胞菌对β-内酰胺类、氟喹诺酮类、氨基糖甙等多类抗生素抑菌环边缘清晰、整齐，易于准确量取，金黄色葡萄球菌对亚胺培南、含酶抑制剂的复合抗生素抑菌环较差。大肠埃希菌对β-内酰胺类、氟喹诺酮类、氯霉素等多数抗生紊纸片的抑菌环边缘不清，抑菌环边缘内侧有3 mm左右的生长圈，影响抑菌环的准确量取。为此，采用进口MH琼脂(Remel公司出品)和进口药敏纸片(OXOID和生物梅理埃公司出品)对比，以及用进口与国产的MH琼脂、药敏纸片交叉试验仍存在类似情况。分析原因，上述三个标准菌株中，大肠埃希菌生长最快，可能在纸片药物扩散过程中，远离纸片处的细菌受到不完全抑制所致。
       另外，用本室保存的肠杆菌科标准菌株：黏质沙雷菌、肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌也存在类似情况。在临床菌株的观察中，革兰阳性菌、非发酵菌抑菌环边缘通常都清晰、整齐。抑菌环直径测量仪特别适合肠杆菌科细菌抑菌环直径的量取，可以克服人工量取的误差。
                                                                                                            编辑：范伟伟