新型口服抗凝药对临床实验室凝血检验的挑战

孔雀明王

       上海交通大学医学院附属第三人民医院检验科主任，副主任技师。1993年毕业于上海第二医科大学，并留校任医学检验系教师。1999年至上海市临床检验中心，担任中心副主任，负责业务和部分行政管理工作。2006年至上海交通大学医学院附属第三人民医院检验科工作，担任科副主任、主任，负责业务和部分行政管理工作。研究方向：临床检验基础的临床实践和质量管理。发表论文几十篇，参编和主编书籍几十本。任中华医学会检验分会血液体液学组委员，医学实验室认可评审员，《检验医学》、《中国实验诊断学》、《诊断学理论与实践杂志》编委。

       近几年，数种新型口服抗凝药的临床应用对临床实验室的凝血检验提出了新挑战。传统抗凝药（如华法林、肝素等）的时代即将过去，此类抗凝药的主要作用是维生素K拮抗剂，能抑制因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的活性，其缺点是需一周左右才能达到抗凝治疗目标水平（如华法林），或因其本身是小分子必须由静脉或皮下注射而不便使用（如肝素）等。
       新一代口服抗凝药有因子Ⅹ a 抑制剂（DFⅩaI，如利伐沙班、阿哌沙班等）和直接凝血酶抑制剂（DTI，如达比加群等），据报道这些抗凝药已能用于临床血栓栓塞性疾病的预防，如心房颤动、髋关节或膝关节置换术，还能用于治疗肺栓塞和深静脉血栓【1】。这类小分子药物的作用机制是可逆性阻断凝血酶或因子Ⅹa的酶活性部位。因凝血酶能使纤维蛋白原转为纤维蛋白，因子Ⅹa能使凝血酶原转为凝血酶，只要抑制其中任何一种凝血因子就能使纤维蛋白凝块形成速率减低。和华法林、肝素作用机制不同，DFⅩaI 和DTI 药物的活性与凝血因子合成减少或抗凝血酶效果加强无关，是一种内源性凝血酶或因子Ⅹa抑制剂。各类型抗凝药的特点比较见表1。

       大型随机化双盲对照临床试验已证实，DFⅩaI和DTI药物在临床上是安全有效的，如RE-LY研究显示，预防血栓的达比加群剂量是每日两次，每次110～150mg，而RE-COVER研究提示，治疗静脉血栓的达比加群剂量是每日两次，每次150mg。据预测市场上会有越来越多的此类药物被批准和应用，此类药物共同优点是起效快、无需限制饮食、很少药物-药物间干扰反应和可预期药代动力学，因此，建议采用固定剂量处方，无需由实验室监测来调整用药剂量，以及无需建立目标治疗范围【2】。
       但是，任何一种药物都不是完美的，目前DFⅩaI和DTI药物尚有如下缺点：严重或部分肾功能不全者不能完全排泄此类药物；缺乏快速逆转制剂或解毒剂；会出现致死性出血【3】；尚无测量此类药物浓度或体外抗凝剂活性的经FDA批准的凝血检验项目。另外，目前已开展的大型临床试验中未监测药物浓度，因此，出血或血栓风险的阈值仍未知。

（一）常规凝血试验的价值

       通常，应用DFⅩaI和DTI药物会干扰常规凝血试验的结果，包括基于凝固法和发色底物法原理的项目。在近年欧洲室间质评活动中，Helin【4】在对含达比加群（Dabigatran）或利伐沙班（Rivaroxaban）药物的血浆标本检测时发现，PT-INR不如APTT敏感，药物浓度越高试剂依赖性变化越明显。基于Owren法的PT凝血酶原酶试剂对达比加群药特别不敏感，几乎所有药物浓度的PT-INR检测结果均在参考区间内，而Quick法的PT试剂对低浓度达比加群药敏感，可达参考区间3倍左右。提示，达比加群用药过量的可能指标是Owren法PT-INR达1.5，Quick法PT-INR达2.0以上。
       Helin研究还表明，所有APTT试剂对达比加群药都很敏感，低药物浓度（120μg/L）其APTT也延长，但变异系数较大（见表2）。对含60μg/L、146μg/L和305μg/L的利伐沙班药APTT试验也较敏感。因此，作者推荐APTT作为达比加群、利伐沙班药的监测试验，当DFⅩaI和DTI 药物浓度很高时，APTT结果不能排除出血风险，因为药物浓度和APTT结果无线性关系。

       Lindahl【5】对含不同浓度达比加群药的血浆标本检测显示，APTT的灵敏度较高，各种药物浓度标本的检测结果均延长，即使是波谷浓度，并与APTT试剂品牌无关（见表3）。而用PT来监测的标本必须进行稀释，其中，Owren法试剂的稀释度要达到1:21，Quick法试剂的稀释度要达到1:3，但部分Owren法试剂的敏感度较Quick法高，高浓度达比加群会使PT-INR增高。因此，作者建议，对服用达比加群药的患者，APTT延长（>90s）、Quick法PT-INR>2或Owren法PT-INR>1.5，应考虑为用药过量或有药物积聚的风险。

       基于常规凝血试验的研究，发现PT和APTT常随新型口服抗凝药浓度增加呈阳性剂量反应曲线，但两种试验的反应性各不相同。对达比加群药来说，APTT试剂较PT试剂更敏感；而利伐沙班药则相反，但Owren法PT试剂对DFⅩaI敏感度较差。两种常规凝血试验在新型口服抗凝药中性能比较见表4【6】。
       APTT结果的剂量反应曲线呈曲线特征，低浓度曲线较陡，高浓度（如>200μg/L）曲线较平坦，PT结果的剂量反应曲线呈线性关系。凝血酶原酶对新型口服抗凝药的灵敏度各异，也就是说与试剂品牌有关，如重组人Inonovin试剂对利伐沙班或阿哌沙班药没有反应，而Recombiplastin是最敏感的凝血酶原酶试剂。传统工作中，通过使用凝血酶原酶特异性ISI，将PT转化为PT-INR是华法林治疗监测结果可比性的有效方法，但对DFⅩaI药则不行。稀释PT凝血酶原酶试剂有助于增加对新型口服抗凝药检测敏感性，但不同品牌试剂之间差异仍存在。随达比加群或利伐沙班药物浓度的增加，PT结果呈非线性表现。

（二）特殊凝血试验的价值【7,8】

       凝血酶时间（TT）试剂对达比加群、利伐沙班太敏感，试验需进一步改良。目前认为，当TT在参考区间内时，可认为达比加群、利伐沙班药未达到有意义的临床浓度。
       基于发色底物法或凝固法的抗Ⅹa试验对达比加群或利伐沙班药很敏感，能提供关于口服抗凝剂活性的定量信息，但不同仪器和试剂检测结果各不相同。发色底物法抗Ⅹa试验是理想的测定DFⅩaI药物活性的方法，如用发色底物法测血浆利伐沙班水平时，先用利伐沙班标准品进行定标，测定时药物剂量与检测结果呈负线性关系，测量下限可达25μg/L。当然，该试验除对DFⅩaI药物特异外，对肝素、低分子量肝素、磺达肝癸钠也敏感。目前，发色底物法测定达比加群药的方法尚在建立，新的测定利伐沙班药的方法也不再受肝素影响。
       凝固法抗Ⅹa试验（如HepTest）是基于抗凝剂催化抑制外源性因子Ⅹa的原理，通过测定抑制率来间接反映标本的凝固时间以估计DFⅩaI 药物活性。随利伐沙班药物剂量增加，HepTest凝固时间会延长，当利伐沙班药物剂量为80mg时，HepTest凝固时间会延长2.3倍，但是，低浓度利伐沙班药（<200μg/L），凝固时间不一定会缩短，即使缩短孵育时间或使用乏AT血浆。总之，在新型口服抗凝药监测中，HepTest较PT和APTT更敏感，但是，常用于低分子量肝素治疗监测的HepTest试验对抗Ⅹa活性测定不特异，受外源性因子Ⅱa的影响。
       凝血酶原酶诱导凝固时间（PiCT）试验是一种测定因子Ⅹa和Ⅱa抑制物敏感的实验。乏血小板血浆添加到含因子Ⅹa、磷脂和印度蝰蛇毒因子Ⅴ激活剂的试剂中，然后与患者血浆共同孵育，因子Ⅴ活化为因子Ⅴa，加入钙后测定凝固时间，常用于抗凝药肝素和低分子量肝素的监测。在测定低浓度利伐沙班药时，需采用牛血清因子Ⅹa代替全血或乏血小板血浆，以防凝固时间缩短。对高浓度利伐沙班药，凝固时间会随浓度增高而延长。总之，在新型口服抗凝药物浓度较低（<50μg/L）时，凝固时间会低于基线值；对达比加群和阿哌沙班药的评价未见报道。
       定量测定DTI 和DFⅩaI 的抗Ⅹa试验较稳定、易定标，但测定因子Ⅹa抑制物浓度较昂贵，不便广泛开展。特殊凝血试验在新型口服抗凝药中性能比较见表5。参考实验室可采用高效液相色谱-质谱法来测定新型口服抗凝药的药物浓度，而临床实验室须先确认该方法在患者标本中适用性才能使用。

       总之，口服抗凝药物监测试验PT和APTT存在高度的试剂依赖性，尚不能准确评价口服抗凝药的效用，临床实验室应评估试剂敏感性才能使用。目前，新型口服抗凝药的出现，对凝血检验的挑战主要是能确保患者接受恰当的、及时的检验，且检验结果报告能正确可靠。

参考文献
[1]Connolly SJ, Ezekowitz MD, Yusuf S,et al. Dabigatran versus warfarin in patients with atrial fibrillation. N Engl J Med. 2009;361:1139-1145.
[2]Schulman S, Kearon C, Kakkar AK, et al. Extended use of dabigatran, warfarin, or placebo in venous thromboembolism. N Engl J Med. 2013;368:709-718.
[3]Southworth MR, Reichman ME, Unger EF. Dabigatran and postmarketing reports of bleeding. N Engl J Med. 2013;368:1272-1274.
[4]Helin TA, Pakkanen A, Lassila R, et al. Laboratory assessment of novel oral anticoagulants: method suitability and variability between coagulation laboratories. Clin Chem. 2013;59(5):807-814.
[5]Lindahl TL, Baghaei F，Blixter IF， et al. Effects of the oral, direct thrombin inhibitor dabigatran on five common coagulation assays. Thromb Haemost. 2011;105:371-378.
[6]Ery CS. Wafarin replacements: good for patients, challenging for laboratories. Chin Chem. 2013;59(5):732-734.
[7]Ery C. Novel anticoagulants and laboratory testing. Int J Lab Hematol. 2013;35:262-268.
[8]Samama1 MM, Guinet C. Laboratory assessment of new anticoagulants. Clin Chem Lab Med. 2011;49(5):761-772.

                                                                                            摘自定向点金《临床实验室》杂志2013年第五期
                                                                                                                   编辑：范伟伟